La fascia inferiore della navata della Basilica superiore è occupata dal ciclo di affreschi più famoso, quello sulla Vita di san Francesco: 28 scene tratte dalla Legenda maior di san Bonaventura che, alla fine del XIII secolo, costituiva la biografia ufficiale del Santo.

Il Vasari riporta che gli affreschi furono terminati da Giotto, chiamato ad Assisi dopo il 1296 da Giovanni da Murlo, generale dell'Ordine. La paternità a Giotto di tutto il ciclo è contestata da molti studiosi. È accertato che l'esecuzione del primo affresco e degli ultimi tre siano da attribuire ad un allievo, il cosiddetto Maestro della Santa Cecilia. Altri studiosi sostengono la mano di Giotto nella maggior parte delle scene e giustificano le variazioni stilistiche con la maturazione formale dello stesso autore unita all'aiuto dei numerosi allievi di bottega. Unanime, invece, è l'attribuzione ad una sola mente dell'impianto generale e dei disegni preparatori.

Le storie, ognuna con il suo titolo in basso, sono ambientate nel mondo medievale della fine del XIII secolo. I personaggi si muovono all'interno di splendidi paesaggi cittadini e rurali con un formidabile senso realistico. Gli episodi, inoltre, racchiusi all'interno di un finto portico, trasmettono l'effetto illusionistico di uno sfondato spaziale che oltrepassa le pareti della chiesa. Le storie del Poverello non iniziano dalla nascita, ma dalla giovinezza; la sequenza narrativa procede dalla prima scena della navata destra e termina con la ventottesima della navata sinistra.

Secondo i più recenti studi, il ciclo di Assisi sembra essere suddiviso in tre gruppi distinti: il primo e l'ultimo di sette quadri ciascuno, il mediano di sette coppie, quattordici in tutto. I primi sette episodi rappresentano l'iter della conversione di San Francesco sino all'approvazione della regola. Il gruppo centrale, considerato evidentemente il principale, mostra tutto lo sviluppo dell'Ordine con San Francesco, sino alla sua morte. Gli ultimi sette sono le esequie e la canonizzazione del Santo, compresi i miracoli post mortem ritenuti necessari a questa. Nel primo gruppo San Francesco è senza l'Ordine, nel secondo è insieme all'Ordine, nel terzo è l'Ordine che prosegue l'opera di San Francesco.