Negli anni recenti si sono levate proteste da parte delle associazioni di animalisti e perfino da alcuni medici veterinari, riguardanti i maltrattamenti subiti dai cavalli, e gli incidenti di gara che provocano rovinose cadute e persino la morte dell'animale. Tali proteste non mancano di riattizzarsi ad ogni nuovo incidente, l'ultima volta in occasione dell'ultimo incidente occorso nel 2004 al cavallo del Bruco Amoroso, che è andato a sbattere contro il colonnino della curva di San Martino per un'improvvida manovra operata dal fantino.

I calcoli sulla percentuale di incidenti causati dal Palio variano di molto a seconda di chi li effettua. Entrambi i dati tengono in conto le edizioni corse dal 2 luglio 1970 sino al 2004. Gli animalisti, con conteggi il cui metodo è contestato dai sostenitori del Palio, danno una frequenza degli incidenti pari al 64,86%. Per contro, i calcoli eseguiti dai sostenitori del Palio, contestati dagli animalisti, danno una percentuale del 2,05%. I dati che fornisce la Lega Anti Vivisezione (LAV) dicono che dal 1970 al 2005 sono morti complessivamente 47 cavalli, considerando sia quelli feriti durante la gara e abbattuti successivamente lontano dalle telecamere, sia quelli morti durante gli interventi. I dati forniti invece dai sostenitori del Palio considerano solo i cavalli effettivamente deceduti in campo.

Per tentare di placare le proteste, a partire dal 2000 il Comune ha adottato nuove misure per garantire la buona salute dei cavalli come l’uso di alte protezioni in PVC in sostituzione dei vecchi materassi collocati presso la curva di San Martino. Dallo scorso anno sono allo studio parapetti imbottiti anche alla curva del Casato, ma per ora non si è trovato un accordo soddisfacente con i gestori dei palchi (in subappalto dal Comune), che dovrebbero arretrare la posizione degli spettatori di mezzo metro sulle tribune e, quindi, diminuire i posti disponibili.

Nell'area della piazza sono state anche introdotte due aree di soccorso riservate alla Misericordia e alla Croce Rossa all'interno degli angoli delle due curve più pericolose, appunto la curva di San Martino e la curva del Casato, dove in passato talvolta gli spettatori, sporgendosi per vedere meglio la corsa, avevano provocato la caduta di cavallo e fantino, che in quei punti hanno sempre cercato di sfruttare strettissime traiettorie, talvolta troppo azzardate. Inoltre il fondo della pista è stato cambiato con una miscela di tufo, monitorato per verificarne umidità e compattezza. Sono stati introdotti anche prelievi di sangue a campione sui cavalli, oltre a regole più restrittive sulla loro selezione (in particolare per ciò che riguarda i purosangue); gli animalisti accusano che tali attività sanitarie sono ancora appannaggio del Comune e non della relativa ASL (Azienda Sanitaria Locale) di competenza. In questo clima teso, nel 2001 la LAV ha chiesto alla Segreteria del Palio di Siena (Comune) copia dei provvedimenti relativi ai cavalli “pensionati” e di altri atti relativi al Palio, ma il Comune si è rifiutato di produrla.

Il tracciato e i cavalli utilizzati, a parere delle organizzazioni animaliste, configurerebbero il reato di maltrattamento di animali. In questo senso sono state presentate varie denunce all'Autorità Giudiziaria; sempre a parere delle organizzazioni animaliste, tra l'altro, la corsa sarebbe priva delle necessarie autorizzazioni, infatti non risulterebbe che il Sindaco di Siena abbia mai chiesto il permesso per organizzare la gara; anche perché sembrerebbe non sentirsi in dovere di farlo, essendo il Palio, non una semplice corsa, ma una secolare tradizione storica popolare che affonda le sue radici nell’antica Repubblica di Siena. E risulta comunque essere già disciplinato e protetto da proprie normative (inoltre pare che il Comune di Siena recentemente si stia muovendo per farlo entrare a tutti gli effetti nel patrimonio storico immateriale dell’UNESCO).

Al di là del merito giuridico, è sicuramente inverosimile la possibilità di fermare la corsa con la Forza Pubblica, visto il coinvolgimento popolare e visto il reciproco rapporto di collaborazione e partecipazione della Forza Pubblica con le istituzioni cittadine (comunali e contradaiole), al fine di garantire il mantenimento dell’ordine pubblico e il regolare svolgimento della festa. Così le Organizzazioni Animaliste negli ultimi anni stanno tentando di convincere la popolazione a vedere la corsa con il punto di vista che dette organizzazioni sostengono essere quello del cavallo. Tentativo del tutto vano, dato che l'intero popolo senese, intensamente legato alla propria tradizione storica del Palio, si è sempre mantenuto compatto nel fronteggiare e combattere contro qualsiasi attacco esterno alla festa.