Nella cattedrale si svolse il Concilio di Firenze del 1438-1439, durante il quale Cosimo il Vecchio, presiedette alla riunificazione fra la chiesa latina, rappresentata da Papa Pio II, e quella bizantina, rappresentata dall'Imperatore Giovanni VIII Paleologo e dal patriarca Giuseppe. In realtà, questo accordo rimase solo sulla carta ed era il tentativo disperato dell'Imperatore di Bisanzio di ottenere aiuto dall'occidente in vista dell'assedio sempre più stretto dei turchi alla sua capitale (l'Impero Romano d'Oriente cadrà infatti poco dopo nel 1453). Nonostante ciò, l'arrivo degli illustri personaggi segnò la raggiunta importanza di Firenze a livello europeo e l'esotico corteo dei dignitari stranieri ebbe un notevole impatto sugli artisti della città, come raffigurato nella Cappella dei Magi di Benozzo Gozzoli.

Il momento più tragico della storia del Duomo si ebbe con la Congiura dei Pazzi, quando fu teatro del brutale assassinio di Giuliano de' Medici e del ferimento di suo fratello maggiore Lorenzo, il futuro Magnifico. Il 26 aprile 1478, dei sicari si appostarono durante la messa per colpire i rampolli di casa Medici, su mandato della famiglia dei Pazzi con aiuti esterni, di papa Sisto IV e di suo nipote Girolamo Riario, tutti interessati a bloccare l'egemonia medicea. Giovan Battista da Montesecco però, che avrebbe dovuto uccidere Lorenzo, si rifiutò di agire in un luogo consacrato, così fu sostituito da uno di minor esperienza. Mentre Giuliano cadeva sotto le numerose coltellate, Lorenzo riuscì, così, a fuggire nella Sacrestia barricandosi dentro, mentre la popolazione fiorentina, favorevole ai Medici, si accaniva contro gli assassini e sui presto scoperti mandanti, in giornate molto drammatiche nelle quali la folla inferocita linciò e fece impiccare sommariamente la maggior parte dei responsabili.

Dal 1491 in Santa Maria del Fiore, inoltre, pronunciò le sue famose orazioni Girolamo Savonarola, frate del Convento di San Marco, improntate all'assoluto rigorismo morale ed ispirate da un grande fervore religioso, durante le quali esprimeva tutto il suo disgusto per la decadenza dei costumi, per il rinato paganesimo e per la sfrontata ostentazione della ricchezza.