La cupola del Brunelleschi ospita anche uno strumento astronomico per lo studio del sole, rappresentato dal grande gnomone creato da Paolo Toscanelli e restaurato da Leonardo Ximenes. Più di uno gnomone vero e proprio, inteso come asta che proietta un'ombra su una zona illuminata, si tratta di un foro gnomonico presente sulla lanterna ad un'altezza di 90 metri, che dà una proiezione del sole su una superficie in ombra, in questo caso il pavimento della cattedrale.

Uno strumento del genere esisteva anche nel Battistero di San Giovanni già attorno all'anno Mille (oggi il foro è stato chiuso), ma nel 1475 l'astronomo Toscanelli approfittò del completamento della cupola per installare una lastra bronzea con un foro circolare di circa 4 centimetri di diametro, che desse un'immagine ottima dell'astro. Studiando infatti il rapporto tra altezza e diametro del foro si ottenne una vera a propria immagine solare stenopeica, cioè in miniatura, capace di mostrare anche le macchie solari o l'avanzare delle eclissi in corso, oppure il raro passaggio di Venere tra il sole e la terra. L'utilizzo più importante dello gnomone al tempo della sua creazione fu quello di stabilire il solstizio esatto, cioè la massima altezza del sole nel cielo a mezzogiorno durante l'anno e, quindi, la durata dell'anno stesso, osservazioni che porteranno insieme ad altre analoghe rilevazioni, come quella del 1510 ricordata da un disco di marmo nel pavimento della cappella Della Croce nell'abside destra della cattedrale, a convincere papa Gregorio XIII circa la necessità di riformare il calendario, allineando la data solare con quella ufficiale e creando il calendario gregoriano (1582).

Nei secoli successivi, lo strumento ebbe modo anche di essere usato per indagini più ambiziose, come quella promossa dall'astronomo della corte granducale Leonardo Ximenes nel 1754, che si propose di studiare se l'inclinazione dell'asse terreste variasse nel corso del tempo, una questione molto dibattuta dagli astronomi del tempo. Le sue osservazioni, confrontate con quelle del 1510 furono incoraggianti e, ripetute per più anni, gli permisero di calcolare un valore dell'oscillazione terrestre congruente con quello odierno. Fu lui che tracciò la linea meridiana in bronzo sul pavimento della stessa Cappella dove è presente il disco di Toscanelli. Alla sua morte lasciò una rendita per l'istituzione di una cattedra di astronomia sperimentale, che divenne il nucleo primordiale dell'Osservatorio Ximeniano, pochi decenni dopo, però, lo gnomone di Santa Maria del Fiore divenne obsoleto, sia per la scoperta di nuove strumentazioni che permettevano osservazioni più precise con l'ingombro di pochi metri, sia perché ci si accorse che le misurazioni erano anche influenzate dai piccoli movimenti della cupola dovute alla temperatura esterna.

Oggi la rievocazione di tali osservazioni ha un carattere prettamente storico e spettacolare, ed ha luogo ogni anno il 21 giugno alle 11 (dato che il vero mezzogiorno avviene un'ora prima rispetto all'ora legale). Per la presenza di ponteggi sul lato sud della lanterna, l'osservazione non si è potuta tenere nel 2005 e 2006.