La cattedrale è costruita sul modello della basilica, ma non è provvista delle tradizionali absidi assiali, bensì di una rotonda triconca saldata all'estremità orientale. il corpo basilicale è diviso in tre navate; i muri della nave centrale sono sorretti da grandi pilastri compositi.

Le dimensioni sono enormi: 153 metri di lunghezza per una larghezza di 38 metri. Le absidi nord e sud del triconco distano fra loro 90 metri. L'altezza dell'imposta delle volte nella navata è di 23 metri, al sommo dell'estradosso delle volte circa 45 metri mentre il dislivello dal pavimento alla cima della cupola interna è di 90 metri. L'interno, piuttosto semplice ed austero, dà una forte impressione di vuoto aereo.

Molte delle decorazioni della chiesa sono state rimosse nel corso del tempo, a volte distrutte a volte spostate nel vicino Museo dell'Opera del Duomo, come le magnifiche cantorie di Luca della Robbia e di Donatello, a causa dei restauri ottocenteschi dell'architetto Baccanti, che coprì di intonaco bianco le pareti.

Alcune opere della cattedrale rispecchiano la sua funzione pubblica, con monumenti dedicati ad illustri uomini ed a comandanti militari di Firenze. Nel Quattrocento, infatti, il cancelliere fiorentino Coluccio Salutati vagheggiava il progetto di trasformarlo in una sorta di Pantheon dei fiorentini illustri,con opere d'arte celebrative. A quel programma decorativo risalgono: "Dante con in mano la Divina Commedia" di Domenico di Michelino (1465), interessante anche per la precisa veduta cittadina del 1465; degli affreschi staccati dei condottieri, sulla parete sinistra, raffiguranti i monumenti a due figure eroiche in cavalcatura trionfante. Entrambi presentano una prospettiva incerta, con due punti di fuga diversi per il piedistallo e la statua equestre; inoltre, i cavalli non potrebbero in realtà stare in piedi perché hanno le zampe alzate entrambe dallo stesso lato. Lo strappo è stato fatto nel XIX secolo. Inoltre, la "Statua equestre di John Hawkwood" (Giovanni Acuto) di Paolo Uccello (1436). Dipinto in bicromia con terra verde e la "Statua equestre di Niccolò da Tolentino" di Andrea del Castagno (1456), in pendant con il precedente, disegnato a imitazione del marmo, forse più bello nella decorazione e nel senso di movimento dell'altro.

Sono invece stati realizzati tra XV e XVI secolo (tranne quello di De Fabris)i busti nella navata sinistra (di Emilio de Fabris, di Antonio Squarcialupi, di Arnolfo di Cambio) e in quella destra (di Giotto, di Brunelleschi e di Marsilio Ficino).

Sopra il portale centrale un grande disco dell'orologio affrescato con ritratti di evangelisti di Paolo Uccello (1443). L'orologio, di uso liturgico, è uno degli ultimi funzionanti che usa la cosiddetta hora italica, un giorno diviso in 24 "ore" di durata variabile a seconda delle stagioni, che comincia al suono dei vespri, in uso fino al XVIII secolo. I ritratti degli evangelisti non sono identificabili col tradizionale ausilio degli animali-simbolo, ma attraverso i tratti fisionomici che richiamano l'animale (o, nel caso di Matteo, l'angelo) simbolico.

Le 44 vetrate colorate antiche sono fra le più importanti in Italia relativamente al periodo fra il Trecento e il Quattrocento. Le bifore della navata e del transetto ritraggono Santi e personaggi del Vecchio e Nuovo Testamento, mentre i grandi occhi circolari sul tamburo rappresentano scene mariane. I principali artisti rinascimentali del tempo disegnarono i cartoni per le finestre, fra i quali Donatello (l'Incoronazione della Vergine, l'unica visibile dalla navata), Lorenzo Ghiberti, Paolo Uccello e Andrea del Castagno. Il rosone raffigura Cristo che incorona Maria su disegno di Gaddo Gaddi (inizio del Trecento). La vetrata ovest del tamburo, visibile solo dall'altare e dal'estremità del transetto è la sola rimasta non istoriata.

Il monumento funebre al vescovo Antonio d'Orso (1323), vescovo di Firenze, fu realizzato da Tino da Camaino. Il Crocifisso dell'altare maggiore è di Benedetto da Maiano (1495-1497). Gli stalli del coro attorno all'altare maggiore sono forse l'opera più riuscita dello scultore Baccio Bandinelli. Tra le poche opere rimaste in loco si segnalano le due terracotte invetriate policrome di Luca della Robbia nelle lunette degli accessi alle sagrestie: angelo con candeliere e Resurrezione di Cristo. All’interno della sacrestia delle messe, sul lato Nord, tarsie lignee dal forte valore prospettico ed illusionistico furono disegnate, sul lato frontale, da Alesso Baldovinetti, Maso Finiguerra ed Antonio del Pollaiolo e messe in opera da Giuliano e Benedetto da Maiano. Sono tra le prime manifestazioni in Italia di questa tecnica, legata agli studi sulla prospettiva. I dodici pannelli bronzei della porta di questa sacrestia furono realizzati da Luca della Robbia. Questo complesso decorativo si completava con le due grandiose cantorie, di Luca della Robbia e di Donatello, poste sopra le porte delle due sagrestie. Nei lavori di ripristino ottocentesco furono smontate e spostate al Museo dell'Opera.

Nella cappella assiale del triconco è collocato l'altare dedicato a San Zanobi, primo vescovo di Firenze. L'urna bronzea sotto la mensa dell'altare è un capolavoro di Lorenzo Ghiberti e contiene le reliquie del santo. Il comparto centrale raffigura il miracolo della resurrezione di un bambino, che sarebbe avvenuto in città nell'attuale Via del Corso (una targa commemora ancora l'episodio sul cosiddetto Palazzo dei Visacci). Il dipinto sovrastante è un'"Ultima cena" di Giovanni Balducci, mentre il mosaico in pasta di vetro del Busto di San Zanobi un tempo qui, oggi si trova nel Museo dell'Opera del Duomo. A questo singolare lavoro, frutto dell'effimero revival del mosaico patrocinato da Lorenzo il Magnifico, nel momento in cui si immaginava di rivestirne l'interno della cupola, si ricollegano le decorazioni a mosaico e globi di pasta vitrea che incrostano i costoloni della volta della cappella.

Alle pareti e su alcuni dei pilastri di sostegno sono collocati, in nicchie architettoniche, statue di apostoli, realizzate per lo più nel Cinquecento. Questo programma iconografico fu iniziato nel quattrocento con Donatello, poi affidato a Michelangelo che però abbandonò la commissione lasciando un San Matteo soltanto abbozzato, oggi al Museo dell'Accademia.

Fra le decorazioni del XVI secolo, relative al periodo granducale, figurano il pavimento marmoreo, attribuito a Baccio d'Agnolo e Francesco da Sangallo (1520-26). Durante i restauri effettuati in seguito all'alluvione del 1966 si scoprì che nel pavimento furono usati, capovolti, alcuni marmi presi dalla facciata incompiuta, demolita in quegli anni.