La chiesa presenta una pianta a croce latina, con i caratteri tipici dell'architettura gotica cistercense, suddivisa in tre navate (quella centrale lunga 100 m) con ampie campate e coperture a volte con archi a sesto acuto decorati in bicromia di marmi verdi e bianchi, sostenuti da pilastri polistili, cioè a sezione mista. Si aprono sulle navate e dietro alle cappelle del transetto delle pregevoli vetrate colorate. Per un effetto prospettico la navata sembra più lunga se guardata dall'abside, perché i pilastri si avvicinano leggermente verso la facciata.

Le vetrate furono eseguite tra il XIV e il XV secolo e fra esse spiccano per esempio la Madonna con Bambino o San Giovanni e San Filippo entrambe disegnate da Filippino Lippi, poste nella Cappella Strozzi. Il rosone che si apre sulla facciata, che raffigura l'Incoronazione della Vergine, è stato disegnato da Andrea Bonaiuto nel XV secolo.

Numerose e di altissimo profilo sono le opere d'arte, fra le quali spicca la Trinità di Masaccio, opera sperimentale sull'uso della prospettiva, a proposito della quali il Vasari ebbe a dire: "Pare che sia bucato quel muro". Rappresenta uno dei più importanti capolavori dell'arte rinascimentale, attuazione dei nuovi canosni stilistici in pittura, al pari dei traguardi architettonici di Brunelleschi e scultorei di Donatello. La scena sacra è ambientata in una monumentale architettura classica, disegnata con punto di fuga realistico per essere guardata dal basso, mentre la figura di Dio sorregge la Croce di Cristo, con un atteggiamento maestoso, eloquente e solenne. Anche le figure dei committenti, i coniugi Lenzi, inginocchiate ai lati della scena, rappresentano un'importantissima novità, dipinte per la prima volta a dimensione naturale, non piccole figurine di contorno, e con un notevolissimo realismo oltre al quale traspare anche il loro senso di religiosità e la devozione. La scritta sul sarcofago è un memento mori.

Il pulpito fu commissionato dalla famiglia Rucellai nel 1443 e fu disegnato da Filippo Brunelleschi, mentre la realizzazione spettò al suo allievo Andrea Cavalcanti. Da questo pulpito fu scagliato il primo attacco contro le scoperte di Galileo Galilei.

Sempre nella navata sono opere notevoli alcuni sepolcri, come la tomba della Beata Villana di Bernardo Rossellino (1451), quella del Vescovo di Fiesole di Tino da Camaino e un'altra di Nino Pisano.