Il Chiostro grande, il più ampio della città, rimaneggiato negli anni 1562-1592 dall'architetto Giulio Parigi su committenza di Eleonora da Toledo, fu affrescato da artisti fiorentini del XVI e XVII secolo (il Poccetti, Santi di Tito, il Cigoli, Alessandro Allori, ecc...) con Storie di Cristo e di santi domenicani; oggi è sede della Scuola sottufficiali dei Carabinieri. Vi si aprono l'antica Biblioteca e gli ex-appartamenti papali, dei quali resta solo la Cappella dei Papi.

Al primo piano del chiostro grande esistevano gli appartamenti usati dai pontefici in visita a Firenze. Vi risiedettero per esempio Eugenio IV durante il Concilio di Firenze, oppure Leone X. Proprio su impulso di quest'ultimo fu realizzato l'unico ambiente superstite del complesso papale, la Cappella dei Papi, affrescata da Ridolfo del Ghirlandaio (Assunzione della Vergine) e dal giovane Pontormo (1515), il quale realizzò una eloquente figura della Veronica che solleva il drappo con il volto di Cristo, con una composizione ed un uso del colore che già sono tipicamente manieristi. Inoltre il soffitto è dipinto con originalissimi motivi a grottesche su sfondo scuro, con nove quadri dove sono ritratti angeli, altre figure e blasoni medicei. Dal lato sud del chiostro si entrava nell'antica Officina di profumeria e farmaceutica detta Farmacia di Santa Maria Novella, che ancora oggi esiste ma alla quale si accede ora da via della Scala. È la più antica farmacia d'Europa, aperta ininterrottamente sin dal Seicento.