Con l'insediamento del duca Cosimo I de' Medici nell'antica sede comunale di Palazzo Vecchio, iniziò la riqualificazione in senso monarchico dell'area cittadina, nel 1560 il duca volle riunire le 13 più importanti magistrature fiorentine, dette uffici, in precedenza poste in varie sedi, in un unico edificio posto sotto il suo diretto controllo, in modo da affiancare al vecchio Palazzo della Signoria una nuova sede governativa, consona al ruolo di potenza rivestito da Firenze dopo la conquista di Siena, scegliendo per questo una striscia di terra, innestata tra il lato sud di Piazza della Signoria e il lungarno.

Il progetto, affidato a Giorgio Vasari, prevedeva un edificio a forma di U, costituito da un braccio lungo a levante, che doveva incorporare anche l'antica chiesa romanica di San Pier Scheraggio, da un tratto breve affacciato sul fiume Arno e da un braccio corto a ponente, inglobando la Zecca Vecchia. In questo secondo lato dal 1866 ebbero sede le Regie Poste, e ora, dopo il restauro del 1988, vi si tengono esposizioni.

I tre corpi di fabbrica presentano lo stesso modulo: a pianterreno un loggiato architravato con volta a botte, delimitato da pilastri con nicchie, finestre architravate al primo piano, infine l'ultimo piano era destinato all'uso privato del duca. La costruzione iniziata nel 1560, realizzata in pietra serena della valle della Mènsola e adottando secondo il Vasari l'ordine dorico "più sicuro e più fermo degl'altri, [...] sempre piaciuto molto al signor duca Cosimo" nel 1565 presentava già completati i cosiddetti Uffizi Lunghi e il tratto che si affacciava sull'Arno. In questa sezione Vasari aprì una grande arcata a serliana sormontata da una loggia, aperta sia sul piazzale antistante che sull'Arno, un vero e proprio fondale teatrale, ispirato alle coeve realizzazioni scenografiche, nell'arcata è la statua di Cosimo I realizzata dal Giambologna nel 1585 tra le statue del Rigore e l'Equità di Vincenzo Danti realizzate nel 1566. Nelle nicchie dei pilastri del loggiato vennero progettate una serie di statue di fiorentini famosi realizzate solo dal 1835.

Per il matrimonio del figlio Francesco con Giovanna d'Austria, nel 1565, il duca decise di realizzare una via di comunicazione soprelevata e segreta tra Palazzo Vecchio e Palazzo Pitti, la nuova residenza della famiglia Medici e collegata direttamente alla cerchia bastionata di Firenze. Il Vasari in soli sei mesi costruì il cosiddetto Corridoio Vasariano, che da Palazzo Vecchio, superata via della Ninna con un ponte coperto, percorre parte della galleria, superando l'Arno presso il Ponte Vecchio, sbuca nel quartiere d'Oltrarno, arrivando nel giardino di Boboli e da qua in Palazzo Pitti; da lì venne in seguito predisposto un collegamento per raggiungere in sicurezza il Forte Belvedere.

Nel 1574 con il duca Francesco I de' Medici la direzione dei lavori venne affidata a Bernardo Buontalenti, che completò la fabbrica, insieme a Alfonso Parigi il vecchio, nel 1580. Tra il 1579 e il 1581 le volte della Galleria furono affrescate con motivi a "grottesca" da Antonio Tempesta e successivamente da Alessandro Allori, con cui collaborarono Ludovico Buti, Giovanmaria Butteri, Giovanni Bizzelli e Alessandro Pieroni.

Nel 1581 Francesco I decise di utilizzare la loggia all'ultimo piano degli Uffizi per realizzare una Galleria destinata ad accogliere la sua collezione di dipinti sia quattrocenteschi che contemporanei, di cammei, medaglie, pietre dure, statue antiche e moderne, di oreficerie, bronzetti, armature, miniature, strumenti scientifici e rarità naturalistiche, ma anche ritratti della famiglia Medici e di uomini illustri. Per allestire la collezione, a partire da quell'anno stesso, il Buontalenti costruì nel braccio lungo degli Uffizi, la Tribuna, ispirata alla Torre dei Venti di Atene, descritta da Vitruvio nel primo libro dell'Architettura, nucleo centrale della Galleria medicea. L'ambiente a pianta ottagonale con cupola un tempo incrostata di conchiglie e madreperla e percorsa da costoloni dorati e lanterna su cui era una rosa dei venti, collegata all'esterno da una banderuola. La Tribuna presenta nelle pareti di rosso scarlatto, dato dalla tappezzerie di velluto, su cui erano appesi i quadri, mensole per oggetti e statue, lo zoccolo, oggi perduto, venne dipinto da Jacopo Ligozzi con uccelli, pesci e altre meraviglie naturalistiche, al centro era un tempietto-scrigno, ovvero un mobile ottagonale che custodiva i pezzi più piccoli e pregiati della collezione; il pavimento venne realizzato a intarsi marmorei.

La sistemazione degli oggetti della collezione di Francesco I nella Tribuna probabilmente seguiva criteri puramente espositivi e non reconditi significati allegorici, il significato è affidato all'insieme, la gloria dei Medici, che grazie alla volontà divina, ha raggiunto il potere terreno, è visibile attraverso l'esposizione di magnifici oggetti rari e preziosi. Nel corso del tempo la Tribuna ha subito numerose trasformazioni, nell'Ottocento l'ordinamento originario venne smembrato e gli oggetti divisi secondo il genere e la categoria di appartenenza, facendo nascere i primi nuclei del Museo degli Argenti, del Museo di Mineralogia e Litologia, di quello Acheologico.

Nel 1583 Francesco I fece trasformare la terrazza, sopra la Loggia dei Lanzi, in un giardino pensile, ora scomparso, dove la corte si riuniva ad ascoltare esibizioni musicali ed altri intrattenimenti. Sempre al Buontalenti spetta la realizzazione del teatro mediceo: un vano circondato da gradinate con nel mezzo il palco dei principi. Nel corso dei secoli il teatro è stato suddiviso in due piani: nel primo ora ha sede il Gabinetto Disegni e Stampe, nel secondo alcune sale della Galleria. Del teatro vero e proprio resta solamente il Vestibolo, dove a sinistra è quello che un tempo era il portale d'ingresso al teatro, oggi ingresso del Gabinetto Disegni e Stampe e di fronte le tre porte del Ricetto, su quella centrale, con le ante lignee intagliate con stemmi medicei, è il busto di Francesco I.

Nel 1587 col duca Ferdinando I de' Medici la collezione venne arricchita con la cosiddetta "Gioviana", una raccolta di ritratti di uomini illustri iniziata da Cosimo I, che oggi si trova esposta in alto tra le travature delle gallerie delle statue.

Per volontà ducale venne realizzata la sala detta "delle carte geografiche" dove alle pareti sono gli affreschi di Ludovico Buti con appunto le carte del "dominio vecchio fiorentino", "dello Stato di Siena" e "dell'Isola d'Elba" e nel soffitto furono posizionate alcune tele di soggetto mitologico realizzate da Jacopo Zucchi. Al centro della stanza era un mappamondo e una sfera armillare (oggi al Museo di Storia della Scienza); inoltre venne realizzato lo "Stanzino delle matematiche" destinato a raccogliere strumenti scientifici, con nella volta la figura della Matematica e nelle pareti, tra le altre, scene con le invenzioni di Archimede.

Per iniziativa di Ferdinando I agli Uffizi furono trasferiti i laboratori granducali e nel 1588 l'Opificio delle Pietre Dure, una manifattura di stato, dedita alla realizzazione di oggetti preziosi, nell'ala di ponente della galleria vennero sistemati i laboratori di orafi, gioiellieri, miniatori, giardinieri, artefici di porcellane, scultori e pittori e per consentire l'accesso venne realizzata lo scalone detto del Buontalenti.

Sempre nella Galleria sette sale vennero destinate ad accogliere la collezione di armi e armature, alcuni soffitti affrescati da Ludovico Buti nel 1588 vennero in seguito ridipinti; alla fine si trovava la sala con le pietre preziose intagliate, portata in dote da Cristina di Lorena. Nel 1591 la Galleria divenne visitabile su richiesta. Col la morte di Ferdinando I nel 1609 la Galleria rimase inalterata per molto tempo.

Tra il 1658 e il 1679, al tempo di Ferdinando II de' Medici, venne affrescato il corridoio di ponente con pitture, di Cosimo Ulivelli, Angelo Gori e Giacomo Chiavistelli, distrutte nel 1762 e sostituite da nuove decorazioni di Giuseppe del Moro, Giuliano Traballesi e Giuseppe Terreni. La moglie di Ferdinando, Vittoria della Rovere, essendo l'ultima discendente dei duchi di Urbino, portò a Firenze la cosiddetta eredità d'Urbino, con uno straordinario nucleo di opere di Tiziano, Piero della Francesca, Raffaello, Federico Barocci e altri. Altre opere di scuola veneta giunsero invece tramite il Cardinale Leopoldo de' Medici, fratello del granduca, che iniziò anche le collezioni di disegni, miniature e autoritratti.

Tra il 1696 e il 1699 sotto Cosimo III de' Medici, vennero decorate le volte del braccio che si affaccia sull'Arno da Giuseppe Nasini e Giuseppe Tonelli, e poco dopo la Galleria venne ampliata nel braccio di ponente dove furono aperti diversi ambienti allestiti con autoritratti, porcellane, medaglie, disegni e bronzetti. Nella Fonderia, ovvero la farmacia, venne allestito il museo delle curiosità naturali, tra cui prendevano posto: mummie, animali imbalsamati, uova di struzzo e corni di rinoceronte. Per quanto riguarda le raccolte, Cosimo III acquistò numerosi quadri fiamminghi (molti i Rubens) e alcune preziose statue romane, come la celebre Venere Medici, un originale greco fra le più importanti sculture della galleria.

Estinta la dinastia medicea nel 1737, con la morte di Gian Gastone, la sorella di quest'ultimo, Anna Maria Luisa, con la Convenzione dello stesso anno, cedette le raccolte medicee alla dinastia dei Lorena, a patto che le opere restassero a Firenze inalienabili. Tra il 1748 e il 1765 venne realizzato un vasto rilevamento grafico, coordinato da Benedetto Vincenzo De Greyss.

Pietro Leopoldo di Lorena, aprendo la Galleria al pubblico nel 1769 e provvedendo alla costruzione di un nuovo ingresso, su progetto di Zanobi del Rosso, promosse una radicale trasformazione della Galleria, affidandone la direzione a Giuseppe Pelli Bencivenni e la riorganizzazione, che fu realizzata negli anni 1780-82, a Luigi Lanzi, che seguì criteri razionalistici e pedagogici propri dell'Illuminismo, con "un suo proprio genere di cose o al più di due" in ogni sala. Nella Galleria venne rimossa l'armeria, venduta la collezione di maioliche e spostati nel museo de la Specola, gli strumenti scientifici; separando in questo modo la scienza dall'arte e concentrando negli Uffizi la pittura, di cui iniziò un riordinamento per scuole, la scultura antica e le arti minori.

Nel 1779 venne realizzata da Gaspero Maria Paoletti la Sala della Niobe, dove vennero allestite un complesso di sculture antiche raffigurante Niobe e i suoi figli, proveniente dalla Villa Medici a Roma.

Tra il 1842 e il 1856, vennero realizzate le 28 statue in marmo, nelle nicchie dei pilastri all'esterno della Galleria, con gli uomini illustri della Toscana dal Medioevo all'Ottocento, tra queste a sinistra sul terzo pilastro la statua di Giotto di Giovanni Duprè, all'undicesimo Macchiavelli di Lorenzo Bartolini e a destra nel quarto pilastro la statua di Sant'Antonino del Duprè.

Nella seconda metà del secolo XIX, gli Uffizi si avviarono a diventare soprattutto una raccolta di quadri, vennero rimosse alcune statue rinascimentali e trasferite al Museo del Bargello e alcune statue etrusche che furono trasferite nel Museo Archeologico. Nel 1900 venne acquistata la quadreria dell'arcispedale di Santa Maria Nuova, tra cui il Trittico Portinari proveniente dalla chiesa di Sant'Egidio, e da inizio novecento si potenziarono aree, come il Trecento e il Quattrocento, estranee al nucleo storico del museo.

Separando il teatro mediceo in due piani e ricavandone sei sale, vennero ristrutturate le prime nel 1956 su progetto di Giovanni Michelucci, Carlo Scarpa, Ignazio Gardella. Nel 1969 venne acquistata la Collezione Contini Bonacossi e nel 1989 vennero recuperate da Rodolfo Siviero le opere sottratte dai nazisti. Il 27 maggio 1993, a seguito di un attentato mafioso che ha provocato la morte di cinque persone e danneggiato alcuni ambienti della Gallerie e del Corridoio Vasariano, molti pezzi della collezione vennero sistemati nei depositi e gradualmente, con i restauri e la messa in sicurezza dell'ala ovest, sono tornati nell'allestimento museale. Nel 1998 il concorso internazionale per la nuova uscita degli Uffizi è stato vinto da Arata Isozaki, ma il progetto, molto criticato, è stato definitivamente accantonato nel 2005. Un altro progetto a lungo termine è la realizzazione dei Grandi Uffizi, raddoppiando la superficie espositiva grazie allo spostamento dell'Archivio di Stato dal primo piano, attingendo opere dai depositi (che sono situati all'ultimo piano) e ampliando così sezioni un po' penalizzate dagli spazi, come quella relativa al Seicento.