Questa sala dedicata ai primi artisti rinascimentali è piena di capolavori, a partire dal capostipite del rinnovamento in pittura, Masaccio, a cominciare dalla prima opera nella quale si intravedono i segni della rottura, la Madonna con bambino e Sant'Anna (Sant'Anna Metterza) del 1424 realizzata con il suo maestro di bottega Masolino da Panicale. Di Masaccio è la Vergine, dipinta con una solenne corporatura così realistica da non potersi più definire gotica. Beato Angelico fu uno dei primi artisti a recepire la nuova sensibilità, come testimonia l'Incoronazione della Vergine del 1435 circa, che, seppur ancora circondata dallo sfondo oro tipicamente medievale, trasmette una sensazione di prospettiva ragionata nel dispiegarsi dei cori degli angeli.

Paolo Uccello fu forse il primo pittore ad essere "ossessionato" dalla prospettiva e ciò è chiaro nella grande tavola della Battaglia di San Romano, parte di un trittico dipinto su incarico di Cosimo il Vecchio che decorava la camera di Lorenzo il Magnifico nel Palazzo Medici, oggi diviso tra la National Gallery di Londra, il Louvre di Parigi e gli Uffizi, appunto. In questa raffigurazione apparentemente caotica della battaglia, tutto è razionalizzato e inquadrato dalla prospettiva che guida il pittore nella disposizione razionale di tutti gli elementi, dai cavalli ai soldati, alle lance degli stessi, che cadute in terra formano figure geometriche.

Importante opera di Domenico Veneziano è la Madonna con bambino e santi, del 1445 circa, una sacra concertazione che si svolge in un ambiente dalla prospettiva realistica, con una luce naturale, tipica dell'autore, che da corpo alle figure.

Molto famosi sono i Ritratti dei duchi d'Urbino di Piero della Francesca del 1465 circa, esemplare via di mezzo fra il realismo (soprattutto dei dettagli, come i gioielli, le acconciature, le rughe della pelle) e l'idealizzazione delle effigi dei duchi, con una grande attenzione anche ai paesaggi e alla prospettiva. Sul retro delle due piccole tavole i duchi sono raffigurati ciascuno sul cocchio di rappresentanza.