La sala più grande e più famosa del museo contiene la migliore collezione al mondo di opere di Sandro Botticelli, compreso il suo capolavoro, la Primavera e la celeberrima La nascita di Venere, due opere emblematiche della sofisticata cultura neoplatonica sviluppatasi a Firenze nella seconda metà del Quattrocento. Queste opere furono realizzate negli anni ottanta del Quattrocento per Lorenzo de' Medici, ma non Lorenzo il Magnifico, bensì un suo cugino che viveva nella Villa di Careggi, con il quale fra l'altro non scorreva buon sangue.

In questa sala si può comunque ripercorrere tutta l'evoluzione pittorica del maestro, dalla Madonna e santi, opera più giovanile legata ancora allo stile di Filippo Lippi, al Ritratto d'uomo con medaglia di Cosimo il Vecchio (1475), dove già si assiste ad una maturazione dello stile legata probabilmente allo studio del realismo di opere fiamminghe, alle opere mitologiche, come la commovente Pallade e il Centauro, allegoria degli istinti umani divisi tra ragione e impulsività, ma guidati dalla sapienza divina.

Con l'avvicinarsi del XVII secolo l'ondata reazionaria ultra-religiosa di Girolamo Savonarola iniziò a farsi sempre più pressante nella società fiorentina e questo si manifesta più o meno gradualmente in tutti gli artisti dell'epoca. Anche Botticelli, dopo un'opera fastosa come la Madonna del Magnificat inizia ad adottare uno stile più severo (Madonna della Melograna, Pala di San Barnaba), con qualche esperimento arcaicista come l'Incoronazione della Vergine dove il maestro torna allo sfondo oro in una scena pare ispirata dalla lettura di Dante. Il periodo più cupo della predicazione savonaroliana porta una definitiva ventata di misticismo pessimista nella sua pittura: La Calunnia (1495) simboleggia il fallimento dello spirito ottimistico umanista, con la constatazione della bassezza umana e la relegazione della verità.

Ma questa sala contiene anche altri numerosi capolavori: particolarmente azzeccata è la collocazione del Trittico Portinari, opera fiamminga di Hugo van der Goes del 1475] circa portata da una banchiere della ditta Medici a Bruges, che con la sua estraneità formale verso le opere circostanti ben rende l'effetto di fulgida meteora che questa opera ebbe nei circoli artistici fiorentini di fine del Quattrocento. A un esame più accurato si iniziano a cogliere però le affinità con le opere realizzate successivamente, la maggior cura dei dettagli, la migliore resa luministica dovuta alla pittura ad olio che i pittori fiorentini cercarono di imitare, arrivando anche a copiare alcuni elementi dell'opera fiamminga, come gli omaggi chiari di Domenico Ghirlandaio nella sua analoga Adorazione dei Magi.