La Tribuna è una saletta ottagonale che rappresenta la parte più antica della galleria. Fu commissionata da Francesco I de' Medici nel 1534 per sistemarvi el collezioni archeologiche e in seguito vi furono collocati tutti i pezzi più preziosi e amati delle collezioni medicee. Divenuta molto popolare ai tempi del grand tour, si dice fu un'ispirazione per le Wunderkammer di numerosi nobili europei. Oggi è l'unica sala nella quale si può comprendere lo spirito originario degli Uffizi, cioè di luogo di meraviglia dove si potessero confrontare direttamente le opere degli antichi, rappresentate dalla scultura, e quelle dei moderni, con le pitture. Attorno al pregevole tavolo intarsiato in pietre dure (del 1649) sono poste in circolo alcune delle più famosa sculture antiche dei Medici, come il Fauno Danzante (replica romana di un originale del III secolo a.C.), i Lottatori (copia di epoca imperiale), l'Arrotino, lo Scita, (copia di una statua della scuola di Pergamo che faceva parte di un gruppo con Marsia), l'Apollino e soprattutto la celebre Venere Medici, un originale del I secolo a.C. acquistata a Roma nel Cinquecento, tra i capolavori assoluti della statuaria classica.

Le pitture sono tutte del periodo dopo il 1530, in particolare risalgono al filone della maestosa pittura di corte fortemente promossa da Cosimo I e da sua moglie Eleonora da Toledo. Di quest'ultima è il celebre Ritratto della Duchessa Eleonora col figlio Giovanni di Agnolo Bronzino, autore anche dei ritratti di Bartolomeo Panciatichi e sua moglie Lucrezia, dei Pricipini medicei e del dipinto del Giovane con liuto. Altri ritratti sono opere del Vasari (Lorenzo il Magnifico), di Jacopo Pontormo (Ritratto di Cosimo il Vecchio), mentre fra i dipinti di soggetto diverso spiccano il Putto musicante di Rosso Fiorentino e la Fanciulla con petrarchino (con il Canzoniere) di Andrea del Sarto.

Il monumentale stipo in pietre dure conteneva la collezione di inestimabili pietre preziose, cammei antichi e pietre dure lavorate, una delle collezioni più amate dai Medici, che spesso facevano incidere le proprie iniziali sui pezzi più pregiati, che oggi sono esposte in diverse sedi, al Museo degli Argenti, al Museo archeologico nazionale fiorentino e al Museo di Mineralogia e Litologia.