Luca Signorelli fu un pittore nativo di Cortona, celebre per la profondità dell'uso del colore e per il senso di tensione e movimento delle sue opere, che furono il modello più immediato per la pittura di Michelangelo. La sua Sacra famiglia per esempio ispirerà il grande artista del Cinquecento nel Tondo Doni. Sempre di Signorelli è la pregevole Madonna con bambino del 1490 circa. La sala è dedicata anche alle opere di Pietro Perugino, uno dei primi maestri della scuola umbra, che ebbe a bottega anche Raffaello Sanzio. Del Perugino sono esposte soprattutto opere legate alla sua attività di ritrattista, come la serie dei Monaci di profilo (1500), il Ritratto di Francesco Mariadelle Opere (1494) o il Ritratto di giovane.

Vicini allo stile pittorico di questi due maestri, troviamo opere di Lorenzo Credi, come l'Annunciazione, e di Piero di Cosimo, celebre epr il tono magico e fantasioso delle sue opere a soggetto mitologico, qui rappresentato dal Perseo che libera Andromeda.