Questa sala, la prima dell'ala ovest, è dedicata al Cinquecento fiorentino. L'opera esposta che attira subito l'attenzione è il magnifico Tondo Doni di Michelangelo Buonarroti, una Sacra famiglia altamente innovativa, sia per la composizione che per l'uso dei colori, che oltre a rappresentare uno dei rarissimi dipinti su tavola del maestro, fra l'altro ancora nella cornice originale forse disegnata da Michelangelo stesso con le graziose teste intagliate che guardano il dipinto, è anche l'archetipo di tutto il manierismo, l'opera con la quale si confrontò tutta la genereazione seguente di pittori. Dipinta verso il 1504, è un'opera non convenzionale per la posa, con il bambino in braccio a San Giuseppe piuttosto che alla Madonna, voltata di spalle. I soggetti in primo piano creano una struttura triangolare sul cui sfondo si staglia la fascia orizzontale dei putti nudi, forse un riferimento al mondo pagano escluso dalla salvezza.

Un'inquietante Salomè (1515) del pittore spagnolo Alonso Berruguete, attivo a Firenze nel primo Cinquecento, si trova pure nella sala, così come opere coeve di Fra Bartolomeo (come l'Apparizione della Vergine a San Bernardo del 1504-1507) e di Mariotto Albertinelli (come la Visitazione del 1503) che risultano ancora più tradizionali dal confronto con le innovazioni di Michelangelo. Tra la sala 24 e la sala 35 si trova l'accesso per il Corridoio Vasariano.