Al secondo piano della Galleria, presso i locali ricavati dall'ex Teatro Mediceo, ha sede la raccolta grafiche, iniziata intorno alla metà del XVII secolo dal cardinale Leopoldo de' Medici e trasferita agli Uffizi nel 1700 circa. La raccolta comprende circa 120.000 disegni e stampe datate dalla fine del Trecento al XX secolo secolo, fra i quali spiccano esempi di tutti i più grandi maestri toscani, da Leonardo a Michelangelo a molti altri, che permettono spesso di stabilire il percorso cretivo di un'opera, attraverso i disegni preparatori, oppure a volte testimoniano, attraverso le copie antiche, opere ormai irrimediabilmente perdute, come gli affreschi della Battaglia di Anghiari di Leonardo da Vinci e della Battaglia di Càscina di Michelangelo, che un tempo dovevano decorare il Salone dei Cinquecento in Palazzo Vecchio, ma che non furono completati e dei quali si perse sia le pitture sperimentali sulla parete, nel caso di Leonardo, sia il cartone preparatorio, nel caso di Michelangelo.