Questa sala venne ricavata sul finire dell'Ottocento dall'antico teatro mediceo. L'allestimento venne completato nel 1956 dagli architetti Michelucci, Scarpa e Gardella, che coprirono la sala, imitando le chiese medievali, con un soffitto a capriate. La sala espone opere databili tra la prima metà del XII secolo e gli inizi del XIV secolo, entrate agli Uffizi a partire dalla fine del Settecento, con la riscoperta dei pittori detti "primitivi".

Tra le tavole, che illustrano gli inizi della pittura toscana, sono due Crocifissi: uno col Cristo trionfante, di iconografia ancora bizantina, l'altro il N. 434 con l'iconografia del Cristo sofferente, una nuovo tipo, che diventerà vincente, da ricollegare soprattutto alla coeva predicazione francescana. L'allestimento, inoltre, mette a confronto le tre grandi pale cuspidate di Cimabue, Duccio di Buoninsegna e Giotto, dipinte a pochi anni di distanza e con lo stesso soggetto: la Madonna in trono. In quella del 1280 realizzata da Cimabue è un primo tentativo di emancipazione dagli stilemi bizantini, dove prevale la ricerca di maggior volume e rilievo plastico, con un'inedita dolcezza di sfumato; di fronte è la pala di Duccio, detta la Madonna Rucellai del 1285 costruita con una struttura ritmica e con figure aggraziate, maggiormente influenzata dalla coeva esperienza pittorica del gotico francese; infine, al centro della sala, la Maestà di Giotto, chiamata anche Madonna d'Ognissanti (1310 circa) di impianto monumentale e costruita molto più plasticamente accentuando il chiaroscuro e la volumetria dei corpi. Di Giotto è anche il polittico di Badia del 1301.