Nella sala, ricavata alla fine dell'Ottocento e ristrutturata negli anni Cinquanta del Novecento, è allestita una selezione di opere senesi del Trecento, in questa si fronteggiano l'Annunciazione (1333), di Simone Martini e Lippo Memmi, e la Presentazione al Tempio di Ambrogio Lorenzetti, entrambe provenienti dal duomo di Siena. L'Annunciazione è costruita con uno stile lineare, elegante e raffinato tipico della coeva cultura cortese che sfocerà nel gotico internazionale, ambientata in un'atmosfera irreale, quasi di astratta misticità, con quale concessione al vero (il fiore, l'ombra del libro, la ritrosia della Vergine), mentre nella Presentazione al tempio di Ambrogio la complessa resa prospettica e l'attenzione alla resa degli affetti delle figure, elementi tipici della poetica giottesca, già ripresa da sua fratello Pietro, viene da Ambrogio conciliate con il gusto per il colore e la grazia della tradizione senese.

Dei fratelli Lorenzetti sono anche esposte altre opere: le Storie di San Nicola (1330 circa), la Madonna con i Santi Nicola e Procolo (1332) di Ambrogio e la Madonna in gloria e la Pala della Beata Umiltà, entrambe del 1340, di Pietro. Di Simone dei Crocifissi, pittore bolognese che si rifà ad un gotico più vivace e popolaresco rispetto al gotico aulico senese, è la tavola con la Natività.