La sala è dedicata alla pittura fiorentina del Trecento, scuola influenzata dall'opera preponderante di Giotto e della sua bottega. Del cosiddetto Maestro della Santa Cecilia, un anonimo collaboratore di Giotto, è la tavola con Santa Cecilia e episodi della sua vita, dove delle scenografiche architetture fanno da sfondo alle figure, come negli affreschi della Basilica superiore di Assisi. I primi giotteschi sono rappresentati da Pacino di Buonaguida, Jacopo del Casentino e Bernardo Daddi. Di Taddeo Gaddi, attivo nella bottega giottesca per ventiquattro anni, è la Madonna col Bambino e sante. Sempre di ispirazione giottesca è il trittico con San Matteo e storie della sua vita di Andrea Orcagna. In queste opere si nota una certa stagnazione dei temi e delle tecniche usate, sempre fedeli al maestro, con progressi minimi nonostante il trascorrere di circa mezzo secolo. Da Giotto si allontana solo il cosiddetto Giottino, qui rappresentato con la Pietà di San Remigio, accentuando l'espressionismo delle figure e utilizzando un colore cromaticamente variato. Di Giovanni da Milano, un artista lombardo attivo a Firenze, appartiene il frammentario Polittico di Ognissanti, dove la preziosità dei dettagli annuncia il gotico internazionale.